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显色基质法检测乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液细菌内毒素含量

彭燕 张玲莉 王宗春（武汉大学人民医院)

[摘要]

目的：建立快速的乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液细菌内毒素定量检查法。

方法：使用显色基质澳门永利对不同批号的乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液分别进行干扰试验考察确立乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液内毒素定量检查法。

结果：表明标准曲线的线性相关系数r≥0.98,乳酸左氧氟沙星在2mg.ml-1浓度无干扰作用。

结论：显色基质法与凝股法比较，有灵敏、快速、能定量、重复性好的特点，可用于乳酸左氧氟沙星内毒素含量的测定。

关键词 显色基质澳门永利法；细菌内毒素；干扰实验；热原；乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液

细菌内毒素检查法主要用于检测注射用药品中可能出现的内毒素污染，以此控制药品中热原的含量。近年来很多分析检验工作者进行相关药物的研究探讨消除细菌内毒素干扰办法。本文对乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液的细菌内毒素检测进行了相应的研究，建立了显色基质法检测该药的细菌内毒素能更快速准确的实现内毒素质量控制。

1.材料与试剂

1.1显色基质澳门永利盒

澳门永利（批号：120402）1.7ml ；显色基质（批号：120403）1.7ml；内毒素标准品（CSE）（批号：120401）10EU；细菌内毒素检测用水（BET）（批号：120418）50ml；偶氮化试剂1（批号120326）10ml；偶氮化试剂2（批号120327）10ml；偶氮化试剂3（批号120328）10ml；HCL反应终止剂（批号120329）50ml。以上产品全部为厦门澳门永利厂生产。

1.2样品

乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液，规格：100ml含乳酸左氧氟沙星0.2g与氯化钠0.9g）

1.3仪器和材料

除热原玻璃反应试管（10mm*75mm试管）、除热原吸头、除热原空安瓿（厦门澳门永利实验厂有限公司）试管架，盛冰水托盘，计时器，涡旋混合仪，精密恒温水浴锅，紫外可见分光光度计，玻璃比色皿，定量可调移液器。

2.方法与结果

2.1 供试品内毒素限值的确定

细菌内毒素限值L=K/M，式中K为人每千克体质量每小时最大可接受的细菌内毒素剂量，注射剂为5EU.kg-1.h-1；M为人用每千克体质量每小时的最大供试品剂量，按照乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液说明书用法用量，成人一次0.4~0.6g静脉滴注维持，约60min滴完，按静注最大剂量600mg纳入计算，1h接受的最大剂量为600mg（人均体质量按60kg计算），则1h的M=10mg.kg-1.h-1。因此，本品的细菌内毒素限值L=0.5EU.mg-1、由于本品的浓度为2mg.ml-1即L=1EU.ml-1。

2.2 标准曲线可靠性试验

取CSE1支，加入1ml BET水复溶，放置旋涡混合器上旋涡混合15min，得到10EU.ml-1溶液，然后用BET水将其稀释至1EU.ml-1溶液，再分别取2ml反应试管15支 ，分别加入细菌内毒素母液1EU.ml-1（0.8，0.6，0.4,0.2,0.0ml）和细菌 内毒素检查用水（0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml） 制成不同浓度的细菌内毒素标准溶液（0.8，0.6，0.4, 0.2, 0.0EU.ml-1），每个浓度平行配制三管，每步稀释内毒素过程均需震荡30s。各取标准溶液0.1ml分别加到预先加有0.1ml澳门永利的反应试管中（冰浴），震荡10s。然后置于37℃水浴箱中10min，取出置冰浴中，加入显色基质0.1ml，再置入37℃水浴箱中6min，取出置冰浴中，依次加入偶氮试剂一，偶氮试剂二，偶氮试剂三各0.5ml。震荡5s后静置5min，在紫外可见分光光度计中检测545nm处吸光度（A），减去空白对照管平均A值。以Δ平均A值对内毒素浓度作线性回归，得标准曲线Y=0.7545X+0.0198，r=0.9970,r≥0.980表明实验有效。

2.3样本的干扰实验

将批号为1130151、1121258、1130266的乳酸左氧氟沙星注射液样品加入BET，稀释为1:2,1:4,1:8,1:16倍数四个稀释级（称为NPC溶液），分别用四个不同稀释级供试品溶液加入1EU.ml-1内毒素标准品，配制浓度为0.5EU.ml-1内毒素溶液（称为PPC溶液）;测量出PPC系列和NPC系列吸光度，用标准曲线计算内毒素浓度，加入外源内毒素的供试品溶液内毒素（Cs），未加外源内毒素的相同稀释倍数供试品溶液内毒素浓度（Ct），按公式计算该条例下的回收率R=（Cs-Ct）/0.5×100%，不同稀释倍数样品检测A值及回收率，见表1。

结果显示，1:2倍样品稀释溶液有一定干扰作用，1:4，1:8,1:16倍稀释的供试品均无抑制作用，回收率在50%~100%之间。

2.4样品的测定

选择样品稀释1:4溶液作为供试品溶液检查各批样品内毒素含量，试验过程不用加入细菌内毒素原液其余加样量同标准曲线制定。供试品内毒素含量的测定，不同批号乳酸左氧氟沙星内毒素检测结果见表2。

3.讨论

3.1显色基质法是继家兔法，凝胶法后被纳入《中国药典》2005年版的法定内毒素检测法，此法是澳门永利检查法进一步地发展和提高。由于其具有快速、灵敏度高、可定量、重复性好的特点。已被广泛应用于样品内毒素含量检测。与凝胶法相比，样品抗干扰能力加强，使用凝胶法测定左氧氟沙星注射液细菌内毒素含量，有文献[1,2]显示，凝胶法测定乳酸左氧氟沙星注射液必须稀释1:16或1:8以后才能排除干扰，进行半定量检测。而显色基质法抗干扰能力好，能够定量测定样品中的细菌内毒素含量，比凝胶法实验结果更准确，科学。

3.2《中国药典》规定，细菌内毒素含量定量方法主要有动态浊度法、终点浊度法、动态显色基质法和终点显色基质法，相比其他测定细菌内毒素含量，终点显色基质法采用混合物中细菌内毒素浓度和其在孵育终点是释放出成色团的数量之间存在量化关系测定内毒素的含量，方法通过检验特定波长中吸光度大小；来定量，具有更好的重复性和可操作性。实验条件简单易行，仅需要可见分光光度计和玻璃比色皿，不需要特别的实验仪器，在实验条件比较简单的实验室或生产厂家均可开展，其他的检验方法通常需要酶标仪或者特定的细菌内毒素检查用设备，因此在实际工作中该方法具有更好的推广应用前景。

3.3显色基质法除了对试验用品和稀释液要求无热原外，对澳门永利灵敏度，内毒素标准曲线，试验样品的干扰试验也有明确的规定和要求[3,4]，其中样品的干扰试验是保证试验结果准确性的关键因素。用供试品溶液配制内毒素回收率在规定的范围内，试验方为有效[5]。目前，排除干扰通常采用样品稀释法和其他适宜的方法。通过试验证明，如果用乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液1:4稀释液作内毒素含量检查，可以达到较好的回收率。本文提供了定量测定乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液中细菌内毒素含量的方法。

参考文献（略）

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