（版权声明：本文来源于网络，仅供学习交流参考，版权归原作者所有，若有不妥之处请联系我司删除。）
高国政 颜锦1
(苏州215011普强苏州制药有限公司;1苏州215011苏州中化药品工业有限公司)
摘要
目的:研究样品pH对细菌内毒素测定的影响。
方法:应用动态浊度法定量测定样品中细菌内毒素的含量;由细菌内毒素参考标准品(RSE)制成两种浓度的稀释液,在14个pH量级上,与国内外两种澳门永利(TAL,LAL)反应;观察每组平均回收率。
结果:pH梯度上,两种澳门永利回收曲线都呈现三个反应高峰,分别为pH 5.20,pH 7.83/pH6.23和pH10.55。样品pH在6～ 8间实验结果稳定,4λ阳性对照的平均回收率为76.5%～ 115.9%和85.8%～ 99.8%;当样品pH值≤ 3或≥ 12时,细菌内毒素试验受到抑制,平均回收率≤ 56.8%。
结论:细菌内毒素试验中应该调节检品pH;使用TAL时,检品pH应预调在(6.5～ 7.5)为好;使用LAL时,检品pH应预调在(6.2± 0.1)或(6.7～ 7.8)为好。
关键词 细菌内毒素;pH;澳门永利(TAL,LAL);动态浊度法
细菌内毒素(endotoxin)主要存在于革兰阴性菌细胞壁的最外层,当细菌死亡、裂解后才会释放出来。其化学成分是磷脂-多糖-蛋白质复合物,主要成分为脂多糖(lipopolysa-charide,LPS),临床上可引起发热、微循环障碍、内毒素休克、DIC等症状[1]。在制药工业中,细菌内毒素被认为是药品热原(pyrogen)的本质[2～ 3]。作为替代家兔热原试验的细菌内毒素试验已被多国药典收载。目前,美国药品食品管理局(FDA)承认3种使用澳门永利检测细菌内毒素含量的方法,即凝胶(gel-clot)法、生色(chromogenic)法和动态浊度(kenitic-turbidimetry)法。中国药典(1995年版)只采用凝胶法。我们应用动态浊度法,定量测定样品中细菌内毒素,并同时使用了东方鲎细胞裂解物(tachypleus amebocyte lysate,TAL)和美洲鲎细胞裂解物(limulus amebocyte lysate,LAL)两种澳门永利,以探索在细菌内毒素试验中,检品pH对测试影响的程度。
1 材料和方法
1.1 试剂和仪器
美国药典细菌内毒素参考标准品(RSE),10 000 EU·瓶- 1;TAL(厦门澳门永利厂,批号960118,灵敏度0.125 EU·ml- 1,1 ml·瓶- 1;LAL(灵敏度0.125 EU·ml- 1,5.2 ml·瓶- 1;LAL溶解水批号4M0757,内毒素含量≤ 0.005 EU·ml- 1,pH 6.23);细菌内毒素测定仪;206型pH计;超净工作台。
1.2 样品处理
氢氧化钠(AR)经185℃ ,4 h烘烤,配制成饱和溶液。浓盐酸(AR)不经处理。按中国药典(1995年版)附录XV F方法,配制成0.1 mol·L- 1的NaOH和HCl溶液,121 ℃灭菌3 h。配制中所用器材都除热原。用新鲜灭菌注射用水(WFI,pH 5.61,内毒素含量 0.03 EU·ml- 1)作稀释液。0.1 mol·L- 1盐酸连续4次10倍量稀释,0.1 mol·L- 1NaOH溶液连续6次10倍量稀释,并采用LAL溶解水(pH6.23)和WFI(pH 5.61)制成14个量级的梯度pH溶液,分别加入RSE制成含细菌内毒素0.5 EU·ml- 1和0.125 EU·ml- 1的样品。
1.3 测定原理和方法
一定量的细菌内毒素和澳门永利在37℃孵化时,混合物的浊度随时间而变化,在反应进行一半(t50)时,混合物浊度的变化速率最快。细菌内毒素测定仪可自动测定各浓度值下的t50,经分析计算后绘制标准曲线,测定方法见表1。阴性对照、阳性对照、空白对照同时立时,测定结果有效。异常值的舍弃依据Smirmoffsl法(n= 4,α0.01= 1.493)。
1.4 标准曲线
1.4.1 LAL标准曲线 按USP规定方法使用RSE,配制稀释液组,标准曲线方程为lg t=0.960 0- 0.386 0 lg c,r= - 0.998 8(n= 4),线性范围0.031 3 EU·ml- 1～ 10.012 8 EU·ml- 1,λ= 0.031 3 EU·ml- 1。
1.4.2 TAL标准曲线 标准曲线方程为lg t= 3.143 2- 0.386 8 lg c,r= - 0.997 9(n=4),线性范围0.125 3 EU·ml- 1～ 10.816 4 EU·ml- 1,λ= 0.125 3 EU·ml- 1。
2 结 果
2.1 试验分成3组,每组有14个样品,其pH递增。第1组加样品0.2 ml(含0.5 EU·ml- 1RSE)和TAL 0.1 ml,该样品中RSE浓度为4λ。第2组加样品0.2 ml(含0.5 EU·ml- 1RSE)和LAL 0.1 ml。第3组加样品0.2 ml(含0.125 EU·ml- 1RSE)和LAL 0.1 ml,该样品中RSE浓度也为4λ。根据各样品的t50,计算回收结果,见表2。pH在4～ 11之间,RSD为1.16%～ 12.29%,s为0.005 0～ 0.054 6,实验的精密度较好。本实验结果发现,两种澳门永利(TAL,LAL)在pH 5.20,pH 7.83/pH6.23和pH 10.55处均有凝集高峰,当pH≤ 3或pH≥ 12时,细菌内毒素试验受到明显抑制(平均回收率≤ 56.8%),见图1。两种澳门永利在pH梯度上的回收有差别,但在pH6～ 8间,回收曲线稳定。
2.2 以pH梯度为横轴,绘制质控图。图中可见几何平均值( x)、最大值和最小值,可同时观察试验的准确度和精密度。依据FDA规定,4λ阳性对照的回收应在标准曲线± 25%以内[2],此处判断动态浊度法检验有效的标准是平均回收率达到(100± 20)%,相应的警戒线为(100±10.7)%。因此,对TAL允许测量值为(0.5±0.1)EU·ml- 1,警戒值为(0.5± 0.053 3)EU·ml- 1,见图2。图中显示:TAL实验的最佳pH为6.68～ 7.12,此时准确度和精密度较为满意,在pH 6.23和pH 7.83均有测量值逸出允许范围。对LAL允许测量值为(0.125±0.025)EU·ml- 1,警戒值为(0.125± 0.013 3)EU·ml- 1,见图3。图中显示:LAL实验的pH值在6～ 8都满足试验的要求,在pH 6.23处,反应可取得较佳回收,在pH6.68～ 7.83时,回收较为稳定。
2.3 反应结束后(t> 4200 s),用pH试纸测定反应混合物pH值,结果见表3。
2.4 观察酸碱对内毒素的破坏作用 0.1 mol·L- 1HCl溶液加入RSE,配成含细菌内毒素1EU·ml- 1的溶液,常温放置3 h,加等量0.1 mol·L- 1NaOH溶液中和后,测得浓度小于0.031 3EU·ml- 1。同法做碱处理组,其测定值为0.533 3 EU·ml- 1(平均回收率为106.7%,RSD= 7.3%,n= 4)。结果表明:常温下强酸液(pH 1)对内毒素有较强的破坏作用,而强碱(pH 13)则无。关于酸或碱对内毒素的灭活还须进一步研究。
3 讨 论
3.1 鲎血细胞溶解物中的凝固酶原,能够被微量的细菌内毒素激活生成凝固酶,促使可凝蛋白向凝固蛋白转化,最终形成凝胶样物质,这是一个极复杂的链式酶原反应[4]。该反应极其灵敏,凝胶形成速率与内毒素浓度成正比,并受温度、反应物中Ca2+/Mg2+离子浓度和pH等因素的影响[4～ 5],温度和pH值的差异直接会影响到多种因子和蛋白质的活性,影响可凝蛋白的转化和凝胶的形成,引起结果的差异。
3.2 在细菌内毒素试验中，对于样品PH问题，《美国药典XX版》规定PH在6-7.5之间，美国药典XXⅢ版中此项规定放宽至PH6-8[6~8]，英国药典（1993年版）规定为PH6.5~7.5[5]。中国药典(1995年版)对此未作具体规定。根据国内外资料的报道,试验的最适pH在6～ 7.5,6.25～7.25或6～7等,这些结论多是以凝胶法中凝胶强度的细微差别来判断,存在较大的主观差异,国内也有报道认为大输液不用调pH值。我们认为pH的调节是必要的,即使样品pH在6～8之间,仍存在规律性的变化,因而不同次的测定中,应调节检品pH值,尽量与标准曲线制作(或澳门永利灵敏度复核)时的pH相一致。
3.3 我们应用动态浊度法,仪器和操作者资格均经过验证。本法使用0.2 ml的样品和0.1ml的澳门永利反应,样品使用量比凝胶法大,因此两种测试方法中pH对细菌内毒素测定的影响可能不完全一样,但从混合物最终pH来看(表3),澳门永利本身具有一定的缓冲能力。当样品pH在5.20～ 9.17时,用pH试纸测得混合物pH基本为7,在这个范围内,动态浊度法仍显示了不同pH对测定结果有较大影响,其原因可能是混合物最终pH的细微差异会较大程度地影响凝胶的形成,但也不排除样品pH对澳门永利中活性成分的影响,从这个角度讲,在pH问题上,两种测试方法是一致的。
3.4 细菌内毒素试验用于临床细菌内毒素血症(endotoxemia)和注射剂如粉针、水针及生物制品的测试时,由于这些检品本身具有一定的缓冲能力,当其pH越偏离6～ 8之间时,对细菌内毒素测定的影响也会越大。
参考文献（略）
如需全文资料，请与我司联系:0592-2085561，谢谢。
